东华大学史向阳教授团队《Adv. Mater.》:包覆金属-多酚网络的树状大分子纳米药物用于肿瘤化疗/化学动力学治疗及MR成像
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恶性肿瘤严重威胁着人类健康,然而传统的治疗方式如化疗、放疗等由于药物的生物利用度低、毒副作用大以及单一治疗模式的疗效有限,使得肿瘤治疗无法达到预期的效果。纳米技术的长足发展使得许多无机或有机-无机杂化纳米药物已被设计用于癌症诊疗。赋予纳米平台对肿瘤微环境(TME)的响应性,选择性地在肿瘤区域释放药物,从而减少化疗的副作用,以及设计包含两种或两种以上不同治疗方式的纳米药物,成为当下肿瘤治疗研究的重点。
羟基自由基(·OH)、单线态氧(1O2)和超氧自由基(•O2−)等活性氧(reactive oxygen species, ROS)成分能够使癌细胞的脂质、蛋白质和DNA产生损伤。近年来,基于ROS的肿瘤治疗手段如声动力治疗(SDT)、光动力治疗(PDT)和化学动力学治疗(CDT)得到了空前的发展。基于金属离子的Fenton或类Fenton反应的CDT,由于其高选择性和低侵入性已成为一种极具发展前景的治疗手段。到目前为止,已有多种无机纳米平台用于CDT,如氧化铁、FePt和金属-多酚网络(MPN)。其中,MPN具有良好的生物相容性、较高的药物负载能力等优点受到了人们的极大关注。作为一种天然多酚的单宁酸(TA)可与Fe3+螯合形成Fe-TA(TF)纳米体系,该复合物具有良好的稳定性、pH响应性和较高的r1弛豫性能,可用于设计肿瘤诊疗一体化纳米药物。
为了实现增强的癌症治疗并进一步减少治疗引起的毒副作用,CDT已经与不同的治疗方式相结合,如光热治疗、光动力治疗和化疗。由于CDT可以诱导癌细胞发生氧化应激(oxidative stress, OS),而OS能够进一步放大内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)。受这一事实的启发,作用于ERS的化疗药物与CDT结合可能是实现增强的联合抗肿瘤治疗的理想选择。一般来说,肿瘤细胞在TME(缺氧、低pH和营养供应不足)中代谢异常,会导致持续的ERS,IRE1α-XBP1是ERS发生的三条信号通路之一,在ERS过程中,IRE1α释放分子伴侣glucose-regulated protein 78(GRP78),从而激活IRE1α的核酸内切酶活性剪接下游XBP1u mRNA形成剪接XBP1 mRNA(XBP1s)。XBP1s可以被翻译成具有生物活性的XBP1s蛋白,从而调节相关基因,使癌细胞适应这种不利的生存环境并存活。丰加霉素(Toyocamycin,Toy)是一种很有效的抗癌药物,可阻止IRE1α对XBP1u mRNA的剪接,从而有效抑制癌细胞生存。因此,结合Toy和CDT,利用CDT促进ERS从而进一步增强Toy引起的基于内质网应激的化疗效果对于肿瘤治疗的研究具有重要意义。
在众多的纳米平台中,聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子以其优异的生物相容性、高度支化结构、独特的内部空腔结构和丰富的外围官能团等特点引起了人们的极大兴趣。PAMAM树状大分子作为药物载体时,不仅可以将药物装载在其内部,而且还可以通过TME刺激响应型共价键将药物连接在其表面。
为了解决单一治疗效果不足以及生物利用度低等问题,利用CDT促进ERS以实现增强的抗肿瘤联合治疗,且实现响应性药物释放以及MR成像,东华大学史向阳教授团队构建了一种包覆金属-多酚网络的树状大分子纳米药物作为内质网应激放大器用于增强的肿瘤化疗/化学动力学治疗及MR成像(图1)。
图1. NHAc-Toy@TF纳米复合物的制备及其在体内作为内质网应激放大器用于肿瘤化疗/化学动力学治疗及MR成像示意图。
研究团队首先在第五代氨基封端的G5 PAMAM树状大分子表面修饰4-羧基苯硼酸(PBA),并乙酰化树状大分子表面的剩余氨基(G5.NHAc-PBA);随后利用Toy的二羟基结构与硼酸基团之间形成具有pH和H2O2敏感性的硼酸酯键将Toy连接在树状大分子表面;最后将制备的G5.NHAc-Toy与TA溶液和FeCl3溶液共混,通过物理吸附将TA-Fe络合物(TF)包覆在G5.NHAc-Toy表面制备纳米复合物G5.NHAc-Toy@TF。制备的G5.NHAc-Toy@TF复合物具有相对均匀的尺寸分布(平均尺寸约50.2 nm)。
研究团队通过1H NMR和FTIR等手段对G5.NHAc-Toy@TF复合物的结构进行了表征(图2a-d)。研究发现,该复合物具有良好的胶体稳定性(图2e),在弱酸性条件下(pH = 5.5)能够显著释放Toy与Fe,且在H2O2存在时Toy的释放得到了明显的增强(图2f-g)。此外,亚甲基蓝(methylene blue,MB)降解实验表明G5.NHAc-Toy@TF能够通过芬顿反应将H2O2转化为·OH(图2h),用于实现CDT。
图2. (a)G5.NHAc-PBA和G5.NHAc-Toy的FTIR表征结果;(b-d)G5.NHAc-Toy@TF的TEM图及粒径分布图;(e)G5.NHAc-Toy@TF在水、PBS以及培养基溶液中的粒径随时间变化曲线;(f-g)不同条件下Toy和Fe的累积释放曲线;(h)MB、MB与H2O2、MB与H2O2 + G5.NHAc-Toy@TF的紫外可见光谱。
团队以小鼠乳腺癌4T1为模型进行了复合物的体外、体内研究,细胞毒性实验发现,G5.NHAc-Toy@TF的半数抑制浓度(IC50, 10.89 μg/mL)远低于G5.NHAc-Toy(19.13 μg/mL),这表明G5.NHAc-Toy@TF具有良好的抗肿瘤效果,且联合治疗的疗效远强于单独的化疗(图3a)。Bio-TEM和ICP结果表明G5.NHAc-Toy@TF能够被细胞吞噬(图3b-d)。细胞内ROS、GSH、LPO以及线粒体膜电位研究结果表明,G5.NHAc-Toy@TF能够引起细胞内的ROS(图3e)和LPO(图3g)显著增加,导致细胞内GSH(图3f)和线粒体膜电位的明显下降(图4b),细胞内线粒体形态在G5.NHAc-Toy@TF处理后发生了明显的皱缩(图4a)。金属离子螯合剂DFO被用于验证细胞内LPO水平的变化是否与Fe相关,结果表明Fe是G5.NHAc-Toy@TF在细胞内发生CDT引起铁死亡的主要因素(图3h)。这些结果表明在经过G5.NHAc-Toy@TF处理后,细胞内发生了CDT,引起肿瘤细胞铁死亡。RT-PCR和Western Blot实验结果表明G5.NHAc-Toy@TF显著抑制了p-IRE1α对XBP1u mRNA的剪接,导致XBP1s的表达显著减少,且CDT导致细胞产生OS,促进ERS的发生(图4c-f),显示G5.NHAc-Toy@TF在细胞水平上具有显著的抗肿瘤活性(图4g-h)。
图3. (a)不用材料处理的细胞活力检测结果;(b-d)细胞吞噬检测结果:(e)经不同材料处理后细胞内ROS变化情况;(f)细胞内GSH水平变化情况;(g)细胞内LPO变化情况;(h)金属离子螯合剂DFO的加入对G5.NHAc-Toy@TF引起的细胞内LPO变化的影响。
图4. (a-b)经材料处理后细胞内线粒体形态及膜电位的变化情况;(c-f)ERS相关基因及蛋白的表达情况;(g-h)细胞凋亡水平分析以及相关蛋白的表达情况。
随后,团队研究了G5.NHAc-Toy@TF在4T1皮下瘤模型中的MR成像性能以及体内抗肿瘤活性。实验结果表明该纳米药物具有良好的MR成像效果(图5a-d),能够在肿瘤部位发生聚集,并可通过网状内皮系统进行代谢(图5e)。
图5. (a-b)G5.NHAc-Toy@TF的MR成像特性检测;(c-d)体内MR成像结果;(e)体内组织分布结果。
体内抗肿瘤治疗研究结果表明,G5.NHAc-Toy@TF无明显系统毒性(图6b),在14天治疗结束后经G5.NHAc-Toy@TF处理的肿瘤体积最小,表现出最强的肿瘤抑制效果(图6c-e)。对肿瘤部位进行免疫组织学观察,显示G5.NHAc-Toy@TF组的凋亡率(62.7%)远高于其他组,且Ki67染色结果表明G5.NHAc-Toy@TF组肿瘤部位细胞增殖率远低于其他组(18.2%)(图6f)。对肿瘤部位的XBP1s、CHOP等的染色结果表明Toy在体内抑制了p-IRE1α的活性,影响了ERS的发生(图6g)。治疗结束后,对各组小鼠的体内主要器官进行H&E染色,G5.NHAc-Toy@TF组各器官均未发现明显损伤,表明制备的G5.NHAc-Toy@TF具有良好的生物安全性。以上结果表明制备的G5.NHAc-Toy@TF能够聚集在肿瘤部位实现MR成像,且在能够携带Toy在肿瘤部位发生响应性释放,并且通过放大内质网应激实现化疗与化学动力学联合治疗。
图6. (a)小鼠体内治疗过程示意图;(b-c)治疗14天内小鼠体重及肿瘤体积变化曲线;(d-e)治疗第14天肿瘤照片与质量;(f)治疗第14天肿瘤切片的TUNEL及Ki 67染色结果;(g)治疗第14天肿瘤切片的XBP1s和CHOP染色结果。
简言之,该研究设计的G5.NHAc-Toy@TF纳米药物具有多个优势:1)金属-酚类网络与树枝状大分子纳米技术相结合,创造了一种基于内质网应激放大的纳米药物;2)Toy的化疗和单宁酸铁络合物的化学动力学治疗导致内质网应激放大而介导的癌细胞凋亡,可通过肿瘤微环境内Toy和铁离子的ROS和/或pH响应性释放而显著增强;3)包被的单宁酸铁络合物使纳米药物具有优异的MR成像特性,可以实现成像引导的癌症治疗。该研究制备的G5.NHAc-Toy@TF为构建新型诊疗一体化纳米药物提供了新的思路。
以上研究成果以“Metal-Phenolic Network-Coated Dendrimer-Drug Conjugates for Tumor MR Imaging and Chemo/Chemodynamic Therapy via Amplification of Endoplasmic Reticulum Stress”为题,在线发表于国际著名期刊Advanced Materials (DOI: 10.1002/adma.202107009)。东华大学化学化工与生物工程学院史向阳教授为通讯作者,硕士生王志强为第一作者。该工作得到了国家自然科学基金委面上项目、上海市科委政府间国际合作项目、上海市科委优秀学术带头人计划和中德科学基金研究交流中心合作研究小组项目等的资助。
原文链接
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adma.202107009
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